Super-resolution optical microscopy

Super-resolution optical microscopy

4Pi-Mikroskopie

Die Auflösung eines normalen konfokalen Lichtmikroskops ist begrenzt auf ca. 200 nm Lateral- und 500 nm Axialauflösung. Mittels der 4Pi-Mikroskopie ist es möglich, die Axialauflösung um einen Faktor fünf zu verbessern und damit bis auf 100 nm vorzudringen. Hierbei wird ein Laserstrahl aufgeteilt und in der Probenebene zur Interferenz gebracht. Das Zusammenspiel von konstruktiver und destruktiver Interferenz führt zu einer deutlich schärferen Punktauflösungsfunktion (PSF).

PSF - konfokal

PSF - 4 Pi

Leica TCS SP2

Im Rahmen der DFG-Initiative „HighLight2004“ zur Förderung hochauflösender Mikroskopie wurde uns ein kommerzielles 4Pi-Mikroskop (Leica TCS 4Pi) zur Evaluation dieser neuen Technologie zur Verfügung gestellt.

Das Mikroskop basiert auf einem Laserrastermikroskop mit hochempfindlichen Fluoreszenzdetektoren. Dadurch ist eine Kombination von hochauflösender Abbildung mit quantitativen Methoden wie FCS, FRET, FRAP u.a. möglich.

Die höhere Auflösung in Axialrichtung ermöglicht vor allem bei dreidimensionalen Rekonstruktionen deutlich schärfere Bilder als bei einem gewöhnlichen Konfokalmikroskop. Dadurch werden insbesondere bei der Untersuchung von zellulären Strukturen bisher verborgene Details sichtbar.

Einige Beispiele:

Aktinskelett einer HeLa-Zelle,

gelabelt mit Rhodamin-Phalloidin

konfokale Mikroskopie

4Pi-Mikroskopie

E. coli,

Membranfärbung mit DiI

konfokale Mikroskopie

4Pi-Mikroskopie

PALM

palm_principle

Due to diffraction the lateral resolution of a standard light microscope is restricted to ~200 nm. Though in recent years methods have been established to overcome that barrier and resolve structures as small as the basic modules of cells. One of these methods is called photoactivation localization microscopy (PALM). The target structure is labeled with photoswitchable respectively photoconvertable fluorescent proteins or dyes.

Because of the activation mechanism it is possible to have only a few spatially well separated fluorophores in an active, i.e. light emitting state. Thus the positions of the single molecules can be determined within the image with a precision way below the diffraction barrier (~20 nm). Out of several thousands of such single frames a high resolution picture can be reconstructed.

Our experimental setup consists of a homebuilt total internal reflection microscope (TIRFM) where the excitation beam is focused into the back focal plane of the objective. The beam can be position so that it hits the sample under an angle larger than the angle of total reflection. Hence the penetration depth of the excitation light is confined to ~100 nm. Multiple laser wavelengths are available for excitation and photoactivation/ photoconversion. The acquisition of the individual frames is accomplished with a highly sensitive camera. During data acquisition the upcoming high resolution picture can be directly observed using software that was developed in our lab.

palm_setup

We investigate fixed and living cells with PALM. Higher resolution images reveal cell structures that are hidden in standard light microscopy.

paxilin_fixiert

Fluorescence images of Paxillin in fixed HeLa cells. (a) TIRFM image consisting of 10,000 individual frames, scale bar 2 µm. (b) PALM image of the pane shown in (a). (c,d) Close-ups (left to right) of the areas marked by a white frame in (a,b) (top to bottom), scale bars 500 nm.

paxilin_live

(a) Overlay of the TIRFM (top and bottom) and PALM (middle) images showing actin bundles in live HeLa cells. The area marked by a white frame is shown in (b) as TIRFM picture and in (c,d) as PALM picture. In doing so the data was analyzed using a Gaussian fitting routine (c) and the fluoroBancroft algorithm (d).

References

Hedde, P. N., Fuchs, J., Oswald, F., Wiedenmann, J., & Nienhaus, G.U., Nat. Meth. 6 (2009) 689-690

“Online image analysis software for photoactivation localization microscopy”